TRANSFORMASI GENETIK TEMBAKAU DENGAN GEN COLD SHOCK PROTEIN (GEN CSP) YANG TAHAN TERHADAP KONDISI LINGKUNGAN

BAGAIMANA TANAMAN DALAM KONDISI YANG STRES ATAU BERADA DALAM TEKANAN PANAS MAUPUN DINGIN BISA BERTAHAN ??

Cold shock protein (Csp) merupakan komponen penting dalam organisme untuk ketahanan terhadap kondisi cekaman abiotik. Gen ini telah disisipkan ke dalam promotor ubiquitin di daerah T-DNA dari pCambia 1300int, dan diintroduksikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Tembakau merupakan tanaman dikotil dan inang alami untuk A. tumefaciens. N. tabacum (Mayo et al., 2006; Bhatti dan He, 2009) dan N. benthamiana merupakan jenis tembakau yang sering digunakan dalam transformasi genetik. Pada jenis N. tabaccum seperti Samsun telah berhasil dilakukan transformasi melalui perantara A. tumefaciens.

Bagaimana caranya ??

Untuk menguji peranan gen Csp dalam toleransi tanaman terhadap cekaman panas atau dingin, maka gen ini diintroduksikan ke dalam genom tembakau. Pengujian tersebut telah dilakukan oleh ilmuwan dengan tujuan untuk mengevaluasi transformasi genetik N. tabacum L. cv. Samsun dengan gen CspB di bawah kendali promotor pUbiquitin dan terminator NosT yang diperantarai A. tumefaciens.

Selain mengandung gen Csp, plasmid ini mengandung gen penanda seleksi II. Transformasi genetik tembakau kultivar Samsun dilakukan dengan menggunakan eksplan yang berupa potongan daun. Potongan daun yang telah diinokulasi dengan A. tumefaciens ditanam pada media penginduksi kalus yang sekaligus berfungsi sebagai media seleksi I. Pada media seleksi I yang mengandung 20 mg/l higromisin, dari 40 eksplan yang diinokulasi A. tumefaciens, hanya 27 eksplan (atau 67,5%) yang membentuk kalus yang dapat bertahan hidup yang kemudian disebut dengan kalus transgenik putatif. Pada media yang sama, semua eksplan yang sebelumnya tidak diinokulasi oleh A. tumefaciens tidak membentuk kalus dan mengalami kematian pada minggu ketiga (Tabel 1).

Tabel 1. Jumlah eksplan yang membentuk kalus di media seleksi higromisin.

Perlakuan*	Jumlah eksplan	Jumlah eksplan yang membentuk kalus yang hidup di
		Seleksi I (20 mg/l higromisin)	Seleksi II (50 mg/l higromisin)
Diinokulasi	40	27 (67,5%)	23 (57,5%)
Tidak diinokulasi	20	0	0
Tidak diinokulasi**	20	-	20 (100%)

Keterangan :

* diinokulasi dengan A. tumefaciens, ** ditumbuhkan pada media non selektif yang tidak mengandung higromisin,

a. Jumlah eksplan tahan di 20 mg/l higromisin + jumlah eksplan awal x 100%;

b. Jumlah kalus tahan di 50 mg/l higromisin + jumlah kalus tahan di 20 mg/l higromisin x 100%.

Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi 20 mg/l higromisin dapat digunakan untuk membedakan kalus transgenik dan non transgenik. Untuk memastikan bahwa kalus yang hidup di media induksi kalus yang juga berfungsi sebagai media seleksi I adalah transgenik, maka kalus tersebut dipindahkan ke media seleksi II yang juga berfungsi untuk regenerasi dengan menaikkan konsentrasi higromisinnya hingga 50 mg/l. Dari 27 kalus yang hidup di media seleksi I, 23 kalus dapat bertahan hidup di media seleksi II yang mengandung 50 mg/l higromisin. Seleksi bertingkat ini dimaksudkan untuk mendapatkan tanaman transgenik yang benar-benar mengandung gen CspB, bukan escape.

                                                 gambar A

                                                  gambar B

                                                  gambar C

                                                  gambar D
Gambar 3. Perakitan tanaman tembakau transgenik yang mengandung gen CspB.

A = eksplan di media seleksi I, B = kalus yang beregenerasi membentuk tunas transgenik,

C = tunas transgenik di media pengakaran, D = tanaman tembakau transgenik T0.

Keuntungan

Tranformasi dengan bakteri ini mempunyai keuntungan di antaranya adalah efisiensi transformasi tinggi, jumlah salinan gen sedikit yang tersisip ke dalam genom tanaman, dan dapat mentransferkan gen berukuran besar (Hiei dan Komari, 2008). Ekspresi gen Csp dalam tanaman transgenik menyebabkan peningkatan ketahanan terhadap berbagai cekaman abiotik. Keberhasilan transformasi genetic tembakau telah digunakan untuk berbagai tujuan seperti mengungkap regulasi sistem biologi tanaman (Langbecker et al., 2004), bioremediasi untuk merkuri (He et al., 2001), tanaman model untuk pengujian cekaman biotik (Waigman et al., 2000), dan abiotic.

Daftar Pustaka

Batti, K.H. and C. He. Agrobacterium mediated tobacco transformation with rice fae gene and segregation analysis of T1 generation. Pak. J. Bot. 2009.  41(1):403-412.

Hiei, Y. and T. Komari. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 2008. 3(5):824-834.

Langbecker, C.L. High-frequency transformation of undeveloped plastids in tobacco suspension cells. Plant Physiol. 2004. 135:139-146.

He, Y.K., J.G. Sun, X.Z. Feng, M. Czako, and L. Marton. Differential mercury volatilization by tobacco organs expressing a modified bacterial merA gene. Cell Res. 2001. 11:231-236.

Waigman, E., M. Chen, R. Bachmair, S. Ghoshroy, and V. Citovsky. Regulation of plasmodesmal transport by phosporilation of tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein. EMBO J. 2000. 19:4875-4884.

Waluyo, S., Sustiprijatno, and Suharsono. Transformasi Genetik Tembakau dengan Gen Cold Shock Protein melalui Perantara Agrobacterium tumefaciens. 2013. http://biogen.litbang.pertanian.go.id/terbitan/pdf/Agrobiogen_9_2_2013_58-65.pdf. Diakses pada tanggal 14 Maret 2013 pukul 19.23 WIB

Waluyo, S. Transformasi Genetik Tembakau dengan Gen Cold Shock Protein melalui Perantara Agrobacterium tumefaciens. 2013 http://repository.ipb.ac.id/handle/123456789/65937?show=full Diakses pada tanggal 15 Maret 2013 pukul 13.10 wib.